Fluorescence Correlation Spectroscopy : membrane fluidity and single molecule detection in concentrated solution
Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence : fluidité membranaire et détection de molécule unique en solution concentrée
Résumé
Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a single molecule technique very well suited
for in vivo studies. We have used FCS to explore plasma membrane microfluidity of living
cells. Measurements were conducted at the single cell level, which enabled us to get a detailed
overview of the typical plasma membrane microviscosity distribution of each cell line studied
(LR73, MCF7, KB3.1, MESSA and MDCKII). A Monte Carlo simulation based on a 2D
diffusion model enables us to link the asymetric fluidity distribution profile with the plasma
membrane micro-organization. This result was used to determine the membrane organisation
related to the surexpression of the P-glycoprotein (Pgp), a protein implicated in multidrug
resistance. We also compare the membrane structuration of various cancer cell lines, each
comes in two versions, a sensitive one and a resistant one to a chemotherapeutic drug : the
Doxorubicin.
Secondly, we propose a new excitation scheme based on a nonradiative energy transfert.
This approach allow us to reduce the illumination depth of the microscope at the nanometric
scale. We demonstrate its potential through two applications : FCS in micromolar solutions
and fluorescence imaging on cells adhesion areas.
La Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence (FCS) est une technique de molécules
uniques particulièrement bien adaptée aux études en milieu biologique. Elle est ici mise en
oeuvre pour analyser localement la membrane plasmique de cellules vivantes. Dans un premier
temps, la distribution de la microfluidité membranaire de cellules vivantes a été caractérisée
grâce à des mesures de temps de diffusion par FCS. Nous avons ainsi pu établir la loi de
distribution de la fluidité membranaire à l’échelle de la cellule unique pour différentes lignées
cellulaires (LR73, MCF7, KB3.1, MESSA et MDCKII). Une simulation Monte-Carlo montre
qu’un modèle simple de diffusion à deux dimensions dans une matrice contenant des microdomaines
visqueux peut rendre compte de l’allure asymétrique typique des distributions obtenues.
Ce résultat a été utilisé pour évaluer les modifications membranaires liées à la surexpression
de la P-glycoprotéine, protéine responsable d’un phénomène de résistance à la chimiothérapie.
Nous avons également comparé la structuration membranaire de diverses lignées cancéreuses,
chacune se déclinant en une version sensible et une version résistante à un médicament : la
Doxorubicine.
Dans un second temps, nous proposons une nouvelle méthode d’illumination locale basée
sur un transfert d’énergie non radiatif. Cette méthode permet de réduire la profondeur de
champ du microscope à l’échelle nanométrique. Nous en démontrons ici le potentiel pour
l’utilisation de la FCS dans des solutions micromolaires ainsi que pour l’imagerie de l’adhésion
cellulaire.
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)
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