Development of LDL based nanodelivery system for drugs and a role of PKCα and PKCδ in the cell death induced by photoactivated hypericin
Développement de nanoparticules dérivées des LDL pour la vectorisation de drogues hydrophobes. Rôle de l’expression de la PKCα et de la PKCδ sur la mort cellulaire photoinduite en présence d’hypéricine
Résumé
Photodynamic therapy (PDT), non-invasive method for cancer treatment requires three necessary components: photosensitizer (pts), light of wavelength equal to the wavelength of pts excitation and oxygen. Activation of pts by irradiation results in a formation of reactive oxygen species at the place of light application and starts destructive mechanism. Low density lipoproteins (LDL) are considered as suitable natural in vivo delivery system for hydrophobic pts such as Hypericin (Hyp) and it was shown that over expression of LDL-receptors in tumor cells can be used for specific targeting. However, in spite of extensive tumor accumulation observed in vivo, Hyp, loaded in LDL, can be redistributed towards others biological macromolecules from plasma before cell delivery process. In using cholesterol modified Dextran (Dch) coating of LDL-Hyp complexes we succeed to decrease such redistribution process. We show that this DCh coating has negligible impact on the cellular uptake of Hyp from [LDL-Hyp]/DCh complexes. Like LDL, high density lipoproteins (HDL) are able to deliver Hyp to cancer cells as well and their interaction was studied. Because isolation of LDL or HDL is difficult and isolated lipoproteins vary in size and composition, synthetic lipid-based nanoparticles (sLNP) was prepared and their interaction with Hyp was measured by fluorescence spectroscopy. These synthesized sLNP are suitable carriers of Hyp and can enter cells by endocytosis. The main aim of our transport system is to selectively accumulate Hyp in the cancer cells. Subsequently, after Hyp accumulation and irradiation, cell death will occur. In the present work we have focused our attention on some regulation processes involved in Hyp photo-induced cell death pathway. In using specific siRNA, the consequence of gene silencing of protein kinase C (PKC) α or δ was examined. Post-transcriptional silencing of pkcα gene expression did not significantly modify cell death level but cell death pathway (apoptosis/necrosis balance) was deeply affected. Our results show that Hyp photo-induced ROS production is significantly increased in PKCα- cells. Such increase of intracellular ROS has been related to the decrease of Bcl-2 phosphorylation as well as to lower level of mitochondrial GSH binding. Post-transcriptional silencing of pkcδ gene expression did not affect type of the cell death when we compared it with the effect of pkcα gene silencing, reduced ROS production and effected Bak and Bax translocation in the cells.
La photo thérapie dynamique (PDT) est une méthode non invasive de traitement de certains cancers qui requiert la combinaison de trois éléments: un photosensibilisateur (pts), une source lumineuse de longueur d’onde adaptée à l’excitation du pts et la présence d’oxygène. La photo activation du pts induit la production locale d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) à l’origine des mécanismes cytotoxiques. Les lipoprotéines de faible densité (LDL) sont considérées comme des vecteurs naturels adaptés au transport des pts hydrophobes tel que l’hypéricine (Hyp) et il a été montré que la surexpression des récepteurs aux LDL dans les cellules tumorales peut être utilisée pour un ciblage spécifique. Cependant, malgré l’accumulation du pts, observée in vivo, dans les cellules tumorales, celle-ci reste limitée du fait de la redistribution de l’Hyp incorporée dans les LDL vers d’autres macromolécules du plasma avant d’atteindre sa cible. Nous avons pu réduire ce processus de redistribution en associant au complexe LDL-Hyp des molécules de Dextran sur lesquelles ont été greffées du cholestérol (DCh). Nous avons pu montrer que l’interaction de ces DCh avait un impact négligeable sur les processus de reconnaissance du complexe [LDL-Hyp]/DCh par les récepteurs au LDL et sur son incorporation cellulaire. Du fait de la grande variabilité de taille et de composition des lipoprotéines et de la complexité d’isolation de fractions pures de LDL ou de HDL, l’utilisation alternative de nanoparticules lipidiques synthétiques (sLNP) pour le transport de l’Hyp a également été étudiée. Nos résultats indiquent que ces sLNP sont des vecteurs appropriés de l’Hyp susceptibles de pénétrer dans les cellules par voie d’endocytose. Dans la perspective d’utilisation de ce type de vecteurs pour une application en PDT, nous nous sommes ensuite intéressés au processus de régulation des voies de mort cellulaire photo-induite par l’Hyp. En utilisant des si-RNA spécifiques, les conséquences de l’extinction de l’expression des gènes de la protéine kinase C α ou δ ont été étudié. Nous avons pu montrer que l’inhibition post-transcriptionelle de ces protéines ne modifie pas significativement le taux global de mort cellulaire mais que cela affecte profondément l’équilibre nécrose/apoptose des voies photo-induites. Nos résultats indiquent, entre autre, une importante augmentation de la production de ROS. Cette augmentation des ROS a pu être corrélée à une réduction de la phosphorylation de Bcl-2 ainsi qu’à une baisse du taux de fixation de la glutathion S-transférase (GSH) au niveau des mitochondries. L’ensemble des ces résultats suggèrent que l’inhibition post-transcriptionelle du gène de la PKCα et la réduction consécutive de la concentration intracellulaire en PKCα affecte considérablement les propriétés anti-apoptotiques et notamment la fonction anti-oxydante de Bcl-2. Cela signifie que la PKCα, en tant que kinase de Bcl-2, protège indirectement les cellules U-87 MG contre le stress oxydatif et la mort cellulaire photo-induite par l’Hyp.
Origine : Version validée par le jury (STAR)